авторефераты диссертаций БЕСПЛАТНАЯ РОССИЙСКАЯ БИБЛИОТЕКА - WWW.DISLIB.RU

АВТОРЕФЕРАТЫ, ДИССЕРТАЦИИ, МОНОГРАФИИ, НАУЧНЫЕ СТАТЬИ, КНИГИ

 
<< ГЛАВНАЯ
АГРОИНЖЕНЕРИЯ
АСТРОНОМИЯ
БЕЗОПАСНОСТЬ
БИОЛОГИЯ
ЗЕМЛЯ
ИНФОРМАТИКА
ИСКУССТВОВЕДЕНИЕ
ИСТОРИЯ
КУЛЬТУРОЛОГИЯ
МАШИНОСТРОЕНИЕ
МЕДИЦИНА
МЕТАЛЛУРГИЯ
МЕХАНИКА
ПЕДАГОГИКА
ПОЛИТИКА
ПРИБОРОСТРОЕНИЕ
ПРОДОВОЛЬСТВИЕ
ПСИХОЛОГИЯ
РАДИОТЕХНИКА
СЕЛЬСКОЕ ХОЗЯЙСТВО
СОЦИОЛОГИЯ
СТРОИТЕЛЬСТВО
ТЕХНИЧЕСКИЕ НАУКИ
ТРАНСПОРТ
ФАРМАЦЕВТИКА
ФИЗИКА
ФИЗИОЛОГИЯ
ФИЛОЛОГИЯ
ФИЛОСОФИЯ
ХИМИЯ
ЭКОНОМИКА
ЭЛЕКТРОТЕХНИКА
ЭНЕРГЕТИКА
ЮРИСПРУДЕНЦИЯ
ЯЗЫКОЗНАНИЕ
РАЗНОЕ
КОНТАКТЫ

Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |

Клинико-экспериментальное обоснование применения интерлейкина-1 для профилактики и терапии поражений при радиационных авариях

-- [ Страница 2 ] --

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и обсуждены на III, IV и V съездах по радиационным исследованиям (Москва, 1997, 2001, 2006), Юбилейной конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 200-летию ВМедА (Санкт-Петербург, 1998), Всероссийских научных конференциях «От materia medica к современным медицинским технологиям» (Санкт-Петербург, 1998), V научно-практической конференции «Радиационные поражения, перспективы развития средств индивидуальной защиты от ионизирующих излучений» (Санкт-Петербург, 2000), Российской научной конференции «Медицинские аспекты радиационной и химической безопасности» (Санкт-Петербург, 2001), Юбилейной научно-технической конференции «Фундаментальные и прикладные проблемы биотехнологии и медицины» (Санкт-Петербург, 2001), I и III съездах военных врачей медико-профилактического профиля ВС РФ (Санкт-Петербург, 2002, 2006), III съезде по радиационным исследованиям (радиобиология и радиоэкология) (Киев, 2003), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы противолучевой и противохимической защиты» (Санкт-Петербург, 2004), международной научной конференции «The peculiarities of medical support of armed forces in contemporary conditions» (Ереван, 2004), научно-практической конференции «Актуальные проблемы обитаемости и медицинского обеспечения личного состава ВМФ» (Санкт-Петербург, 2004), Всероссийской конференции «Механизмы стресса в экстремальных условиях» (Москва, 2004), международной научной конференции «Радиобиологические эффекты: риски, минимизация, прогноз» (Киев, 2005), Российской научной конференции с международным участием «Современные проблемы военной и экстремальной терапии» (Санкт-Петербург, 2005), XXX World Congress on Military Medicine (St. Petersburg, 2005), Российской научной конференции «Медико-биологические проблемы токсикологии и радиологии» (Санкт-Петербург, 2008), международной научно-практической конференции «Актуальные психолого-педагогические и медико-социальные проблемы социума и безопасности жизнедеятельности» (Санкт-Петербург, 2009).

Связь диссертационного исследования с плановой тематикой научно-исследовательской работы учреждения. Исследование выполнялось в соответствии с плановой тематикой научно-исследовательских работ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова (темы НИР № 4.01.030.п2 шифр «Беталейкин», № 4.01.034.п2 шифр «Протектор», № 03.02.012.0808/0292 шифр «Гемопоэз», № 02.02.02.0810/0192 шифр «Цитокин»).

Публикации. По теме диссертационного исследования опубликовано 45 научных работ, том числе 12 статей в научных журналах по перечню ВАК Минобрнауки РФ.

Объём и структура диссертации. Диссертация изложена на 228 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, двух глав результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. В диссертации приведены 45 таблиц и 19 рисунков. Список литературы содержит 333 библиографических источника, из них 162 отечественных и 171 иностранных публикаций.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Оценку эффективности интерлейкина-1 в качестве средства профилактики и ранней терапии радиационных поражений проводили в экспериментах на мелких лабораторных животных (мышах и крысах) и в исследованиях с облучением проб периферической крови здоровых людей in vitro. В целом с использованием радиобиологических, гематологических, биохимических, иммунологических и цитохимических методов исследования было изучено более 80 клинико-лабораторных показателей.

Экспериментальные исследования выполнены на 2224 мышах-самцах (1852 белых беспородных, 124 линии BALB/c, 248 гибридах CBA x С57В1 первого поколения) массой 18-20 г и 180 белых беспородных крысах-самцах массой 180-220 г разводки питомника РАМН «Рапполово» (Ленинградская обл.). Содержание, питание, уход за животными и их выведение из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу Минздрава СССР от 12.08.1977 г. № 755).

Рентгеновское облучение мышей осуществляли на установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 15 мА, фильтре 0,5 мм Сu + 1,0 мм Al, фокусном расстоянии 70 см, мощности дозы 54 Р/мин, направлении облучения: спина–грудь. Внешнее острое -облучение мышей осуществляли на установке ИГУР-1 с изотопом 137Cs; мощность экспозиционной дозы составляла 130 Р/мин, кожно-фокусное расстояние 1 м, облучение двухстороннее боковое.

Внешнее пролонгированное (мощность дозы – 1 Р/мин, время экспозиции – 16 ч) -облучение в дозе 10 Гр проводилось с помощью -установки с источником 60Со, расположенном на расстоянии 161 см от поверхности тела лабораторных животных. Сочетанное внешнее и внутреннее радиационное воздействие проводили путем инкорпорации крысам 239Pu, 137Cs и 90Sr сразу после окончания внешнего пролонгированного -облучения в дозе 8 Гр. Суммарная удельная активность вводившихся крысам радионуклидов позволила обеспечить формирование к 30 сут опыта дозы внутреннего облучения 2 Зв, а эффективная доза сочетанного облучения составила 10 Зв.

Моделирование фракционированного радиационного воздействия осуществляли на установке РУМ-17. Животных облучали один раз в сутки в дозе 0,5 Гр в течение 50 дней до набора суммарной дозы облучения 25 Гр.

Дозиметрический контроль условий облучения осуществлялся расчетным и ферросульфатным методом с последующей оценкой результатов на спектрофотометре. Кроме того, в ходе каждого облучения животных проводилась физическая дозиметрия с помощью индивидуального дозиметра ИД-11 с последующей оценкой показаний прибора на аппарате ГО-32.

Наблюдение за животными, подвергнутыми острому рентгеновскому и -облучению, пролонгированному -облучению, сочетанному внешнему и внутреннему облучению, фракционированному облучению осуществляли в течение 30 сут после окончания радиационного воздействия.

В работе использовался стандартный фармакопейный препарат “Беталейкин” – ампулированный лиофилизированный рекомбинантный ИЛ-1 человека с добавлением в качестве стабилизатора человеческого сывороточного альбумина, созданный и выпускаемый Государственным научно-исследовательским институтом особо чистых биопрепаратов (г. Санкт-Петербург). Рекомбинантный интерлейкин-1, представляющий собой точную копию эндогенного ИЛ-1 человека, прошел все требуемые Фармакологическим комитетом МЗ РФ испытания и приказом Министра здравоохранения РФ № 51 от 18.02.1997 г. разрешен к клиническому применению. Использованная в работе серия препарата прошла биотест и по своей биологической активности была идентична предыдущим сериям.

Мышам препарат, разведенный на физиологическом растворе в объеме 0,2 мл, вводился внутрибрюшинно в дозе 50 мкг/кг (1 мкг/особь) однократно. Крысам препарат, разведенный в 0,2 мл физиологического раствора, вводился внутрибрюшинно в дозе 1 мкг/кг (200 нг/особь) однократно. Животные контрольных групп вместо препарата ИЛ-1 получали физиологический раствор в том же объеме и в те же сроки, что и животные опытных групп.

Оценку радиомодифицирующих свойств рекомбинантного ИЛ-1 проводили по разработанной нами схеме, которая включала последовательное изучение критериев выживаемости облученных животных, параметров радиочувствительности гемопоэтических клеток костного мозга, количества клеток циркулирующего пула периферической крови, показателей функционально-метаболического статуса нейтрофильных гранулоцитов крови.

Изучение выживаемости и средней продолжительности жизни экспериментальных животных проводили общепринятыми методами. По полученным результатам оценки выживаемости при дозах СД50/30 рассчитывали фактор изменения дозы (ФИД) и процент защиты препарата интерлейкина-1.

Оценку числа и функциональной активности стволовых кроветворных клеток осуществляли методами эндогенного и экзогенного колониеобразования [Till J.E., McCulloch E.A., 1961] по количеству колоний, выросших на селезенках мышей на 9 сут после облучения. Общее количество лейкоцитов определяли меланжерным методом с последующим подсчетом клеток в камере Горяева. Для исследования лейкоцитарной формулы применяли способ быстрой окраски мазков крови краской Романовского [Альтгаузен А.Я., 1964]. Суммарное цитохимическое выявление катионных белков в нейтрофилах проводили с использованием лизосомально-катионного теста [Пигаревский В.Е., 1988]. Определение уровня липидов осуществляли с использованием судана черного Б [Sheehan H.L., Storey G.W., 1947]. Оценку щелочной фосфатазы проводили методом азосочетания [Kaplow L.S., 1955]. Цитохимическое выявление миелопероксидазы осуществляли методом R.C. Graham, M.J. Karnovsky (1966).

Кроме того, в исследовании приняли участие 6 практически здоровых мужчин в возрасте 27-32 года, пробы периферической крови которых использовались для изучения реакций лейкоцитов при облучении in vitro после введения им препарата рекомбинантного интерлейкина-1. Исследования на здоровых людях выполнялись с информированного согласия испытуемых и соответствовали этическим нормам Хельсинской декларации 2000 года. Фармакопейный препарат ИЛ-1 «Беталейкин», предварительно разведенный физиологическим раствором, вводился людям внутривенно капельно в дозе 5 нг/кг в течение 3-х часов. Оценку реакций лейкоцитов у испытуемых проводили до введения препарата, через 3, 6 и 24 ч после начала введения ИЛ-1.

Облучение проб периферической крови людей in vitro проводилось на установке РУМ-17 при напряжении 180 кВ, силе тока 15 мА, фильтре 0,5 мм Cu + 1,0 мм Al, фокусном расстоянии 70 см, мощности дозы 35,5 Р/мин. Лейкоциты периферической крови обследованных людей исследовали до облучения и непосредственно после радиационного воздействия. Дозиметрический контроль осуществляли расчетным методом и с помощью дозиметра ИД-11.

Состояние здоровья добровольцев оценивали по данным анамнеза (отсутствие острых и хронических заболеваний), субъективным показателям (отсутствию жалоб на состояние здоровья), в ходе физикального клинического (термометрия, показатели артериального давления, пульса, тоны сердца, частота дыхания и др.) и лабораторного исследования. Общеклиническое лабораторное исследование крови включало определение общего количества лейкоцитов, эритроцитов, тромбоцитов и ретикулоцитов, изучение лейкоцитарной формулы, оценку абсолютного и относительного содержания лимфоцитов и гранулоцитов, выявление уровня гемоглобина, гематокрита и СОЭ. С помощью биохимического анализатора оценивали содержание в крови общего белка, альбуминов, глобулинов, глюкозы, билирубина, активность АЛТ, АСТ, ЛДГ, ЩФ, тимоловую пробу, уровень мочевины, креатинина, холестерина, триглицеридов, бета-липопротеидов, С-реактивного белка, протромбина, время рекальцификации, каолиновое время, индекс коагуляции, этаноловый тест, фибриноген, толерантность к гепарину, тромботест.

Иммунологические исследования включали оценку количества и функциональной активности иммунокомпетентных клеток. Абсолютное число и относительное содержание CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD20+, CD25+, CD95+ и HLA II оценивали с помощью соответствующих моноклональных антител методом проточной цитометрии [Summer H., Abraham D., 1997]. Пролиферативную активность лимфоцитов изучали в реакции бласттрансформации путем определения ответа на фитогемагглютинин (ФГА) в дозах 2,5 мкг/мл или 15,0 мкг/мл и митоген лаконоса (PWM) в дозе 5,0 мкг/мл [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998]. Способность мононуклеаров синтезировать и продуцировать интерлейкин-1, интерлейкин-4, фактор некроза опухолей- и интерферон- определяли по F.H. Krouwels с соавт. (1997).

Эффекторные свойства нейтрофильных гранулоцитов оценивались по спонтанной и индуцированной форболмиристатацетатом (ФМА) адгезивной способности [Кетлинский С.А., Калинина Н.М., 1998], а также по спонтанной и направленной миграционной активности под агарозой к N-формил-лейцин-метионил-пролину и к интерлейкину-8 [Nelson R.D., 1975]. Функциональный потенциал нейтрофилов изучали в тесте с нитросиним тетразолием (НСТ-тест), который проводился в спонтанном и стимулированном зимозаном вариантах [Rook G.A. еt аl., 1985]. Функциональную активность нейтрофилов оценивали хемилюминесцентным методом [Muto S., 1986]. Способность нейтрофилов к завершенному фагоцитозу изучали в тесте с дрожжами, определяя число поглощающих дрожжи клеток и фагоцитарный индекс [Root R.К. еt аl., 1975]. Кроме того, в нейтрофилах периферической крови цитохимическими методами определяли содержание катионных белков [Пигаревский В.Е., 1988], липидов [Sheehan H.L., Storey G.W., 1947], миелопероксидазы [Меньшиков В.В. и др., 1987], щелочной фосфатазы [Kaplow L.S., 1955].

Полученные в ходе исследований данные подвергали обработке методами вариационной статистики с использованием пакета программ «Statistica» с расчетом среднего значения, ошибки средней и среднего квадратического отклонения. Для оценки значимости межгрупповых различий по критериям выжи­ваемости пользовались точным методом Фишера. Оценку различий средних значений в экспериментах с большим количеством лабораторных животных и нормальным распределением средних величин проводили с использованием t-критерия Стьюдента. Оценку различий данных, полученных при анализе выборок малого объема, проводили непараметрическими методами с использованием критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Обработка результатов, представленных в относительных единицах, осуществлялась с использованием таблиц В.С. Генеса (1967), основанных на точном методе Фишера для четырехпольной таблицы. Вероятность p<0,05 и выше считали достаточной для вывода о статистической достоверности различий полученных данных.

Данные в таблицах представлены в виде X ± mx. Различия по t-критерию Стьюдента обозначены звездочкой (*), различия по критерию Вилкоксона-Манна-Уитни – решеткой (#).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние интерлейкина-1 на выживаемость и среднюю продолжительность жизни экспериментальных животных

при различных вариантах радиационных воздействий

Целью первого раздела исследования явилась экспериментальная оценка радиозащитной эффективности рекомбинантного интерлейкина-1 (ИЛ-1) при профилактическом и раннем лечебном применении для различных вариантов внешнего, внутреннего и сочетанного радиационного воздействия. Для реализации цели были проведены экспериментальные исследования на мышах и крысах, в ходе которых изучалось влияние ИЛ-1 на показатели выживаемости и средней продолжительности жизни облученных лабораторных животных.

Определение оптимальных сроков профилактического и лечебного применения ИЛ-1 для достижения максимального радиозащитного эффекта препарата проводилось в экспериментах на 120 белых мышах-самцах, подвергнутых внешнему -облучению в дозе 6 Гр с мощностью дозы 130 Р/мин.

В результате проведенных исследований было установлено, что ИЛ-1 при введении за 24 ч до облучения и через 1 ч после радиационного воздействия обладает выраженным радиозащитным эффектом, что позволяет рассматривать его в качестве нового лечебно-профилактического средства обеспечения безопасности при чрезвычайных ситуациях радиационного характера (табл. 1).

Таблица 1

Зависимость выраженности радиозащитного эффекта интерлейкина-1, оцененного по показателям выживаемости (%) и средней продолжительности жизни (сут) белых беспородных мышей-самцов, подвергнутых острому однократному -облучению в дозе 6 Гр, от сроков применения препарата (n = 10 в каждой группе)

Условия эксперимента Сроки введения ИЛ-1, ч Выживаемость, % СПЖ, сут
Облучение на фоне применения ИЛ-1 – 72 60 ± 16 14,1 ± 1,6 *
– 24 80 ± 13 * 14,6 ± 1,5 *
+ 1 70 ± 16 * 13,0 ± 0,9 *
+ 24 40 ± 17 10,2 ± 1,2
+ 72 10 ± 5 9,1 ± 0,9
Контроль (облучение) 30 ± 15 8,8 ± 1,3
* – различия достоверны (p < 0,05) по сравнению с контролем (облучением)


Pages:     | 1 || 3 | 4 |   ...   | 6 |
 








 
© 2013 www.dislib.ru - «Авторефераты диссертаций - бесплатно»

Материалы этого сайта размещены для ознакомления, все права принадлежат их авторам.
Если Вы не согласны с тем, что Ваш материал размещён на этом сайте, пожалуйста, напишите нам, мы в течении 1-2 рабочих дней удалим его.